10X GENOMICS pipeline

Cellranger 软件流程

（一）环境搭建

下载Cell Ranger,下载10X GENOMICS配套的参考基因组.官网也提供了Cell Ranger Pipeline。

官网下载链接： https://support.10xgenomics.com/single-cell-gene-expression/software/downloads/latest

(1)下载、安装Cell Ranger软件

#下载
curl -o cellranger-6.0.1.tar.gz "https://cf.10xgenomics.com/releases/cell-exp/cellranger-6.0.1.tar.gz?Expires=1620565659&Policy=eyJTdGF0ZW1lbnQiOlt7IlJlc291cmNlIjoiaHR0cHM6Ly9jZi4xMHhnZW5vbWljcy5jb20vcmVsZWFzZXMvY2VsbC1leHAvY2VsbHJhbmdlci02LjAuMS50YXIuZ3oiLCJDb25kaXRpb24iOnsiRGF0ZUxlc3NUaGFuIjp7IkFXUzpFcG9jaFRpbWUiOjE2MjA1NjU2NTl9fX1dfQ__&Signature=IN508xcNVbAtoHul8SUog8KHmlAhg2lbR6-hCQeiwPs~-EfvTL1JmDurZ3dV-k3ry7TO9WP5Ae11yceDSzCfVIqglxHp6Pad4CftaStozIuEU7XJ0JbtDTO3DFVHRkpgNR8k48dNADA~JnhcHx8zOsT23VEeugqc7Z~35~05SOG8GJjxSJ8qGSTBdHYt7kPyqfZVs2apryxLOV-QBho66LvD4NLqNXFvzkPZ8t0e9Cv4rrV1JXseqY6PJnK8TPozTnDBnhfkop30FZ~jOLEY8wObOIA4b~EoyskSGjSfcvnp5urI7xjAyQNC6XtlJmRwDWEwWovgicScei2gkZqOGw__&Key-Pair-Id=APKAI7S6A5RYOXBWRPDA"
#安装
##解压
tar zxvf cellranger-6.0.1.tar.gz
##添加环境变量
echo 'export PATH=/home/gongyuqi/10X/cellranger-6.0.1:$PATH' >> ~/.bashrc
##永久生效环境变量
source ~/.bashrc
#查看本机的配置，看看是否满足跑单细胞数据的最低配置
cellranger sitecheck > sitecheck.txt
less -N sitecheck.txt
#最后，测试一下下载安装的cellranger能否正常运行
cellranger testrun --id=testcellranger 

标准输出最后两行为如下结果，表示cellranger可以正常使用

(2)下载人类参考基因组

curl -O https://cf.10xgenomics.com/supp/cell-exp/refdata-gex-GRCh38-2020-A.tar.gz
tar -zxvf refdata-gex-GRCh38-2020-A.tar.gz

查看一下文件的组成结构

(3)下载小鼠参考基因组

curl -O https://cf.10xgenomics.com/supp/cell-exp/refdata-gex-mm10-2020-A.tar.gz
tar -zxvf refdata-gex-mm10-2020-A.tar.gz

(二)下载测试数据

在这里要用到prefetch和ascp的组合，详细的软件安装以及测试数据下载请参考单细胞数据下载

(1)pretch下载SRA文件

#refetch默认通过https的方式下载原始数据，速度上会有限制
#如果存在ascp，prefetch默认通过fasp的方式下载数据，速度一下载从骑自行车升级为开飞机
cat sample.txt|while read id
do nohup prefetch $id -O ./ && echo "${id}.sra done" &
done

(2)ascp下载

#其中两个样本不在ncbi中，所以我们这里用直接用ascp下载EBI中存储的SRA文件，两个样本就不写循环了
ascp -QT -l 300m -P33001 -i ~/.aspera/connect/etc/asperaweb_id_dsa.openssh era-fasp@fasp.sra.ebi.ac.uk:vol1/srr/SRR772/009/SRR7722939 ./
ascp -QT -l 300m -P33001 -i ~/.aspera/connect/etc/asperaweb_id_dsa.openssh era-fasp@fasp.sra.ebi.ac.uk:vol1/srr/SRR772/002/SRR7722942 ./

(三)Cell Ranger 使用

(1)SRA格式转成fastq格式

cd /home/gongyuqi/project/scRNA-seq/raw_data
#--split-files生成三个文件，第一个文件的所有序列都是8bp，第二个文件都是26bp，第三个文件都是91bp，第三个文件是测序reads
ls *.sra|while read id
do nohup fastq-dump --gzip --split-files -A $id &
done

(2)重命名文件

ls *.sra|while read id
do mv ${id}_1*.gz ${id}_S1_L001_I1_001.fastq.gz; mv ${id}_2*.gz ${id}_S1_L001_R1_001.fastq.gz; mv ${id}_3*.gz ${id}_S1_L001_R2_001.fastq.gz
done

命名前

命名后

(3)质控

ls *R1*.gz > sample_fastq.txt
ls *R2*.gz >> sample_fastq.txt

(4)cellranger count

cellranger是软件最核心的部分，可以完成细胞鉴定，基因组比对，过滤，UMI计数，细胞降维，聚类，差异分析等功能。内部流程很多，但是使用很简单。

#首先进入到cellranger_count文件夹下面并建立存放各个样本结果的文件夹
cd /home/gongyuqi/project/scRNA-seq/cellranger_count
cat sample.txt|while read id;do mkdir $id;done
#将下列代码编辑到脚本文件cellranger_count.sh中
cat sample.txt|while read id
do
cellranger count --id=$id \
                 --transcriptome=/home/gongyuqi/10X/refdata-gex-GRCh38-2020-A \
                 --fastqs=/home/gongyuqi/project/scRNA-seq/raw_data \
                 --sample=$id \
                 --nosecondary \
                 --localcores=16 \
                 --localmem=64 > ${id}.log 2>&1
done
#给脚本文件执行权限
chmod +x cellranger_count.sh
#后台运行脚本文件
nohup ./cellranger_count.sh &
#参数解析
#--id: 指定输出文件存放目录
#--transcriptome: cellranger兼容的参考基因组位置
#--fastqs：重命名好的fastq.gz文件位置
#--sample：fastq.gz文件文件前缀，以作为软件识别的标志
#--nosecondary：只获得表达矩阵，不进行后续的降维、聚类和可视化（这些工作用R包做，如Seurat）
#--jobmode=local: 指定cellranger在本地运行（cellranger默认也是在本地运行）。它会占用90%的空余内存和所有空余的CPU。如果要进行资源控制，使用--localmem或者--localcores
#--localcores: 限定cellranger最多同时使用的cpu个数
#--localmem：限定cellranger最多占用的内存大小

以SRR7722937为例，来看一下cellranger count的结果总结：Barcode,UMI,mapping情况，样本的信息（使用v2试剂，参考基因组，cellranger版本），reads与测序饱和度、基因数量的关系（正相关，情理之中~）

(5)cellranger aggr

第一步构建输入文件信息，文件内容如下。如果整合的样本既有v2试剂也有v3试剂，需要在第三列加上相应的试剂信息。如果都是用的同一种试剂，只需要保留前两列的信息即可。如本次测试数据。

#--id为输出文件保存的位置
#--csv为输入文件的信息
cellranger aggr --id=patient_2586-4 \
                --csv=patient_2586-4_libbrary.csv \
                --normalize=mapped

同样的，来查看一下cellranger aggr的结果报告。报告的消息解读可参考：https://www.jianshu.com/p/30de2aea4b74?utm_campaign=maleskine&utm_content=note&utm_medium=seo_notes&utm_source=recommendation

1、Count Summary

2、Count Analysis

3、Alerts

(四) Cell Ranger输出结果导入R

cellranger aggar运行完成之后，在outs文件夹下面的子文件夹filtered_feature_bc_matrix中的三个文件上传到本地，解压导入R中。

library(Matrix)
barcode.path<-paste0("barcodes.tsv")
feature.path<-paste0("features.tsv")
matrix.path<-paste0("matrix.mtx")
mat<-readMM(file = matrix.path)

feature.names<-read.delim(feature.path,
                          header = FALSE,
                          stringsAsFactors = FALSE)
barcode.names<-read.delim(barcode.path,
                          header = FALSE,
                          stringsAsFactors = FALSE)
colnames(mat)<-barcode.names$V1
rownames(mat)<-feature.names$V2
mat[1:4,1:4]
dim(mat)